疫苗是目前预防由严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2)引起的2019冠状病毒病(COVID-19)最有效的措施。然而，目前可用的疫苗可能对新出现的SARS-CoV-2变种(如Delta菌株(B.1.617))不是很有效。

背景

目前仍迫切需要开发对SARS-CoV-2及其新变体更有效的增强型COVID-19疫苗。大多数COVID-19疫苗都是使用野生型SARS-CoV-2毒株的刺突(S)蛋白开发的，因为已知它含有中和表位。然而，已经发现S蛋白S1结构域的突变增加了包括Delta变异在内的新变异的传播性和毒力。

核衣壳蛋白(N)是一种结构蛋白，在核糖核酸(RNA)结合和复制中起重要作用。由于N蛋白比S蛋白更保守，且具有较高的免疫原性，可能是合适的COVID-19疫苗靶点。

早前的报道表明，烟草中产生的重组N蛋白可以引起有效的体液反应。重组蛋白在植物体内的瞬时表达是一种在短时间内高产出具有功能活性的重组蛋白的有效且经济的系统。

在最近的疫苗研究中，科学家们利用benthamiana植物生产了n蛋白和一种含有n蛋白和sars - cov - 2s受体结合域(RBD)的抗原鸡尾酒。为此，研究人员还研究了这些产品是否有可能引发针对SARS-CoV-2的免疫反应。

在植物中产生N蛋白和抗原混合物(N+RBD)n benthamiana

在benthamiana植物中表达了Gen加入号为YP_009724397的N基因和GenBank加入号为MN985325的SARS-CoV-2变体RBD的S基因，并由Biomatik Corp.重新合成。

通过在N和RBD序列的N端添加一个信号肽，在c端添加一个ER保留信号序列，并在c端添加FLAG表位，对N和RBD序列进行进一步修饰。

将得到的N和RBD序列插入pEAO二值表达载体中，得到两个质粒pEAQ-N和pEAQ-RBD。然后，它们被转移到农杆菌AGL1菌株中，并随后渗透到N. benthamiana的叶片中。N和RBD蛋白也通过浸润pEAQ-N和pEAQ-RBD质粒共表达。内糖苷酶H (Endo H)是一种重组糖苷酶，可以检测植物表达的N蛋白的N糖基化状态。将pGreen-Endo H质粒与携带pEAQ-N的AGL1菌株共浸润，在benthamiana中共表达，评估其n-糖基化状态。

鉴定植物产生的N蛋白和N+RBD抗原混合物

采用Western blot法和酶联免疫吸附法(ELISA)测定45 mg/kg植株叶片中N蛋白的表达量。采用反flag亲和层析纯化，每千克植物生物量可获得22 mg纯蛋白。

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blotting检测到在benthamiana中表达的n蛋白分子为双偶蛋白，分子量约为48和24 kDa。值得注意的是，两者均可通过抗flag抗体和N蛋白特异性单克隆抗体(mAb)检测到。这证实了48kda和24kda形式在与单克隆抗体反应时都表现出特异性，另外24kda片段也包含单克隆抗体识别的表位。

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n蛋白和Endo H的共表达不会导致条带移位。此外，使用Pro-Q Emerald 300糖蛋白染色进行的聚糖检测分析没有检测到聚糖的存在，从而证实N. benthamiana中产生的N蛋白不是N糖基化的。

将含有表达N蛋白质粒pEAQ-N的农杆菌与表达RBD的质粒pEAQ-RBD渗透到植物叶片中，产生抗原鸡尾酒。采用单步反flag亲和层析纯化N蛋白和N+RBD鸡尾酒蛋白。

SDS-PAGE和Western blot分析显示，抗原混合物中存在三种蛋白，分子量分别为48kDa (N蛋白)、36kda(对应于糖基化(g) RBD)和24kda (N蛋白)。

anti-FLAG亲和层析纯化的N和N+ gRBD蛋白的凝胶过滤层析也证实了N蛋白洗脱液中存在双峰，N+ gRBD洗脱液中存在三峰。SDS-PAGE分析显示，洗脱的部分存在一个48kDa的全长N蛋白，抗原鸡尾酒中存在48kDa (N蛋白)和36kda (gRBD)蛋白。

通过37℃孵育24、48、96、72、96小时，对48 kDa的植物产全长N蛋白进行稳定性分析。37℃孵育48小时，N蛋白降解率低于50%。在-80°C下保存6个月，观察到没有降解。

抗原鸡尾酒N+RBD引起强烈的免疫反应小鼠鼻塞

在6-7周龄Balb/c雄性小鼠中检测了植物产生的N蛋白和抗原混合物(N+ RBD)的免疫原性。小鼠分别于第0天和第21天肌肉注射5微克(mg) N或0.3% Alhydrogel吸附的N+ RBD。

免疫小鼠于第21天和第42天采集小鼠血清进行ELISA检测。在5 mg的剂量下，N和N+ RBD在免疫小鼠中诱导了显著的高抗体滴度。值得注意的是，与单独的RBD或N蛋白相比，抗原鸡尾酒N+RBD引起更高的抗体滴度。

N+ gRBD在Vero E6细胞中表现出对SARS-CoV-2活感染的中和活性

采用微量中和试验评估植物产和抗flag亲和层析纯化的N和N+gRBD免疫小鼠血清的抗sars - cov -2中和活性。评价小鼠血清对Vero E6细胞中SARS-CoV-2活感染的中和活性。

小鼠用5 μg植物产N蛋白吸附在醛水凝胶上。在第一次给药后第21天和第二次给药后第42天收集小鼠血清，并评估其中和活性。结果发现，在这两个时间点从这些小鼠收集的血清没有表现出中和活性。

同样，用5 μg植物产N + gRBD吸附在醛水凝胶上免疫小鼠。有趣的是，在第一次免疫后第21天和第二次免疫后第42天收集的小鼠血清对SARS-CoV-2的中和活性分别为1:8和1:128。

此外，在第二次免疫后第42天收集的小鼠血清中，仅给予5 μg植物产生的gRBD，其中和活性为1:128。用约2.3 μg gRBD和约2.7 μg N蛋白(约5 μg)联合免疫小鼠的血清显示出类似的1:128的中和活性。这提示N蛋白可能在增强N+gRBD鸡尾酒抗原对SARS-CoV-2的中和活性中发挥作用。